胶质母细胞瘤（GBM），作为最常见且高度致命的恶性脑肿瘤，患者的平均生存期约为14个月。尽管目前在综合治疗和支持治疗等方面取得了诸多进展，但总体预后仍然不佳，长期生存率很低。磷酸肌酸（Phosphocreatine, PCr）是一种天然代谢物，除了在细胞能量代谢中扮演着至关重要的角色外，越来越多的研究表明了PCr具有其他调解作用，特别是促进肿瘤转移。但是目前PCr在促肿瘤方面的机制还不是很清楚。来自国家生物医学分析中心南湖实验室满江红/周涛团队团队在Cancer Discovery（IF=29.7）发表了题为“Phosphocreatine promotes epigenetic reprogramming to facilitate glioblastoma growth through stabilizing BRD2”的文章，该研究发现胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）提升PCr的产生，促进肿瘤细胞生长。机制上，增加的PCr是由于其肌酸激酶（CK）被转录激活导致的，PCr可以靶向结合染色质调控因子BRD2，抑制其泛素化，从而促进GSCs表观遗传重编程，加速GBM进展。该研究为深入理解GSCs的代谢特性以及GBM的临床治疗提供了新思路。

01  胶质母细胞瘤中的PCr水平增加

研究人员利用LC-MS和ELISA对临床GBM患者样本中的PCr水平进行了定量分析，结果显示GBM中PCr水平升高（图1A）。在GBM异种移植模型小鼠体内，进一步发现是胶质母细胞瘤干细胞GSCs中PCr的表达更高（图1B）。随后，利用单细胞测序和TCGA数据集分析，并通过WB和IF等实验验证，发现PCr的代谢酶肌酸激酶同工酶CKB在GBM肿瘤细胞中高表达（图1C）。结合在GSCs中敲除CKB的实验结果，表明GSCs通过上调CKB的表达而产生高水平的PCr（图1D）。进一步探究GSCs中CKB表达增加的机制，发现GSCs中的转录因子ZEB1结合CKB启动子区域，从而增强了GSCs中CKB的转录。敲除实验和荧光素酶报告基因结果显示，ZEB1与其共激活因子KAT2B相互作用，促进GSCs中CKB的转录激活（图1E）。

图1 胶质母细胞瘤中的PCr水平增加

研究人员进一步探究PCr对GSCs维持和GBM进程的潜在影响。生物发光成像结果显示，在原位GBM异种移植小鼠模型中，CKB基因的缺失，降低了PCr水平，抑制了GSCs的增殖和GBM生长，并且有效延长了小鼠生存期（图2A-B）。使用环肌酸（cCr）阻断PCr的生成能够抑制GSCs的维持和增殖，显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长并延长生存期，而在补充PCr后，能够恢复GSCs的生长和增殖（图2C-D）。这些结果表明，抑制PCr的生物合成，可以有效地控制GBM发展进程。

图2 PCr促进GSCs增殖和GBM生长

03  PCr 直接结合BRD2促进GBM进展

为了探究PCr对GBM的调控机制，研究人员采用pull down+MS技术对GSCs细胞中与PCr相互作用的蛋白进行了鉴定（图3A-C）。他们评估并分析了两个GSCs细胞系中PCr潜在的结合蛋白，并通过分子对接和SPR实验进行验证，首次发现了PCr与BET蛋白家族成员BRD2直接结合（图3D-E），并抑制BRD2与E3泛素连接酶SPOP之间的相互作用，从而抑制BRD2的降解，促进BRD2介导的染色质调控事件，最终促进GSCs增殖和GBM生长。

图3 PCr 直接结合BRD2促进GBM进展

04  抑制PCr的生物合成可能是GBM临床治疗新策略

通过ChIP-seq和RNA-seq进一步探索BRD2对GSCs基因转录的调控，发现PCr与BRD2的相互作用能够促进GSCs的转录激活和细胞增殖（图4A）。功能性实验结果证实，使用环肌酸cCr阻断GSCs中PCr的生物合成，BRD2的转录激活作用减弱（图4B）。此外，研究人员发现，与单独使用BRD2抑制剂JQ1相比，联合应用环肌酸cCr和JQ1对GBM肿瘤的抑制作用更为显著，并且能够显著延长模型小鼠生存期（图4C-D）。以上结果表明，抑制内源性代谢物PCr生成的环肌酸cCr有望成为治疗GBM的一种新型药物。

图4  抑制PCr的生物合成可能是GBM临床治疗新策略

总结与讨论

本研究发现ZEB1/KAT2B复合物通过促进CKB的转录，导致GSCs中PCr高表达。研究人员利用pull down+MS技术在GSCs中筛选PCr的靶向结合蛋白，同时采用SPR和分子对接方法进行验证。最终揭示了PCr体内的新机制，即通过靶向结合BRD2，抑制其降解，对GSCs进行表观遗传重编程，最终加速GBM进展的作用机制。

中药物质基础研究及小分子药物靶点发现一直是达吉特专注的科学领域，我们希望达吉特能为越来越多的中药及复方走向全世界的过程中提供有价值的技术支持。

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高精度鉴定；

2）中药有效成分与代谢物组织空间分布

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）天然产物化合物库筛选