中药活性成分是创新药物的重要来源，发现其作用靶点对揭示中药理论的物质基础并诠释中药理论的现代科学内涵至关重要｡大连医科大学药学院马骁驰教授团队长期致力于中药及其复方的体内药效物质与作用机制研究，前期我们解析过该团队发表的两篇高水平文献，见“大连医科大学马骁驰团队一个月发表两篇IF>10 中药小分子靶点文章”，报道了2022年3月发表的两篇中药小分子文章如下：

2022年3月1日，该团队在PNAS（IF=12.779）发表研究，发现中药苦参活性成分苦参酮在直接靶向sEH减轻帕金森病症状。

2022年3月9日，该团队在Signal Transduct Target Ther（IF=38.104）发表研究，发现中药紫草活性成分紫草素直接靶向NEMO/IKKβ抑制结直肠癌进展。

近期，该团队又发表了2篇中药小分子文章：

2023年1月，该团队在Int J Biol Sci（IF=10.750）发表研究，发现泽泻活性成分泽泻醇B直接靶向sEH减轻顺铂诱导的急性肾损伤。2023年3月，该团队在ACS Cent Sci（IF=18.728）发表研究，发现金盏花活性成分蟛蜞菊内酯直接靶向sEH减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。

01  泽泻醇B直接靶向sEH减轻顺铂诱导的急性肾损伤

泽泻醇B（Alisol B）是一种从东方泽泻（Alisma orientale）中分离出来的具有C-17侧链的四环原甾烷骨架的化合物，具有抗炎、抗过敏等药理活性。已有研究报道其类似物23-乙酰泽泻醇B能够缓解急性肾损伤（AKI）和慢性肾脏疾病（CKD）的病程，具有肾脏保护潜力。顺铂（Cisplatin）是一种无机铂类化疗药物，其临床使用常伴有明显的肾毒性，导致AKI的发生。Alisol B对顺铂诱导的AKI是否存在保护作用及其作用靶点和潜在机制尚不清楚。2023年1月，大连医科大学药学院马骁驰教授团队在Int J Biol Sci（IF=10.750）发表题为“Direct targeting of sEH with alisol B alleviated the apoptosis, inflammation, and oxidative stress in cisplatin-induced acute kidney injury”的文章，发现泽泻醇B直接靶向sEH减轻顺铂诱导的急性肾损伤中的凋亡、炎症和氧化应激。

1、泽泻醇B改善AKI的作用及机制

研究首先通过腹腔注射顺铂造小鼠急性肾损伤模型，发现Alisol B能够以剂量依赖的方式显著增加小鼠体重、降低肾脏系数，且显著降低顺铂诱导的肌酐和尿素氮水平（图1A）。HE、PAS染色表明Alisol B能够改善顺铂诱导的肾组织损伤（图1B），表明Alisol B对顺铂诱导的AKI具有保护作用。进一步研究发现，Alisol B通过p53通路减弱顺铂诱导的肾细胞凋亡（图1C），通过NF-κB通路保护顺铂诱导的炎症（图1D），通过Nrf2通路缓解顺铂诱导的氧化应激和内质网应激（图1E）。

图1 泽泻醇B改善AKI的作用及机制

2、泽泻醇B改善AKI的直接靶点

为了鉴定Alisol B的直接靶点，研究采用Pulldown+MS方法在63kDa处的蛋白条带中鉴定到可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH，基因Ephx2）（图2A），已有报道称sEH的表达和活性与肾脏疾病有关，Ephx2基因缺失和sEH抑制均可减轻肾脏疾病。进一步采用Pulldown+WB（图2B）、DARTS（图2C）、CETSA（图2D）和SIP（图2E）验证发现Alisol B缓解了蛋白水解酶、温度和有机溶剂对sEH稳定性的影响，SPR发现Alisol B和sEH有较强的亲和力（图2F），分子对接（图2G）和突变实验（图2H）发现Alisol B通过与Gln384发生氢键相互作用与sEH结合。

图2 泽泻醇B改善AKI的直接靶点

3、泽泻醇B通过靶向sEH发挥作用

sEH能够调控EETs的水解代谢，形成DHETs。研究发现顺铂刺激EETs水平降低，DHETs水平增加，而Alisol B可起到相反效果，EETs和DHETs的比值表明Alisol B在体内抑制了sEH活性（图3A）。已有研究报道内源性EETs可以调节GSK3β（一种丝氨酸/苏氨酸激酶）的活性，而GSK3β可调控p53、NF-κB和Nrf2信号通路影响凋亡、炎症和氧化应激。研究人员发现顺铂诱导的AKI中p-GSK3β蛋白水平显著下降，而Alisol B改善这一结果（图3B）。GSK3β抑制剂LiCl消除了Alisol B对顺铂诱导的HK-2细胞中IL-6、HO-1和Nrf2表达水平的影响（图3C）。使用WT和sEH KO小鼠开展动物实验发现，sEH KO小鼠改变顺铂诱导的肾功能降低以及肾脏形态改变，同时抑制了Alisol B的保护作用（图3D）。sEH基因缺失逆转了顺铂诱导的EETs减少和DHETs增加，促进了GSK3β的磷酸化，抑制顺铂诱导的氧化应激、内质网络应激和炎症反应（图3E-G）。总之，研究表明Alisol B通过抑制sEH活性来提高EETs水平，触发GSK3β介导的p53、NF-κB和Nrf2通路来减弱顺铂诱导的AKI。

图3 泽泻醇B通过靶向sHE发挥作用

泽泻醇B作用机制模式图如下：

02  蟛蜞菊内酯靶向sEH治疗脂多糖诱导的急性肺损伤

蟛蜞菊内酯（WED）是从金盏花（Wedelia calendulacea）中分离得到的一种具有C-3和C-4的苯并呋喃部分的多酚，具有抗炎、抗癌和肝保护以及缓解帕金森病和肾脏损伤的作用。已有研究发现它可以减轻睑肌瘤介导的肺纤维化中的肺胶原沉积和纤维化病理，保护支气管上皮细胞免受香烟烟雾提取物诱导的损伤。WED在巨噬细胞介导的呼吸系统疾病，特别是急性肺损伤（ALI）中是否存在保护作用及其保护机制和作用靶点尚不清楚。

2023年3月，大连医科大学药学院马骁驰教授团队在ACS Cent Sci（IF=18.728）发表题为“Macrophage Inactivation by Small Molecule Wedelolactone via Targeting sEH for the Treatment of LPS-Induced Acute Lung Injury”的文章，发现蟛蜞菊内酯靶向sEH治疗急性肺损伤。

1、蟛蜞菊内酯改善ALI的作用及机制

研究首先通过体外实验发现WED在体外可通过NF-κB通路缓解体外炎症反应（图4A）以及Nrf2途径缓解体外氧化应激（图4B）。在体内可减轻LPS诱导的ALI小鼠的肺损伤（图4C），减轻炎症反应（图4D）和氧化压力（图4E）。

图4 蟛蜞菊内酯改善ALI的作用及机制

2、蟛蜞菊内酯改善ALI的直接靶点

为了鉴定WED的直接靶点，研究采用Pulldown+MS方法在63kDa处的蛋白条带中鉴定到可溶性环氧化物水解酶（sEH，基因Ephx2）（图5A）。进一步采用Pulldown+WB（图5B）、IP-MS（图5C）、DARTS和CETSA（图5D）、MST（图5E）和免疫荧光共定位分析（图5F）验证了WED与sEH的直接结合。进一步研究发现WED显著抑制人和小鼠的sEH活性，提高sEH底物14,15-EET水平并降低LPS诱导的巨噬细胞中其二醇水平，表明 WED 与 sEH 的直接结合作用。进一步分子动力学模拟发现WED与sEH氨基酸残基Phe36和Gln384的两个氢键相互作用（图5G）。将Phe362和Gln384分别突变为Phe362Ala和Gln384Ala后，Pulldown、CETSA、DARTS显示突变消除WE与sEH的结合（图5H）。在LPS刺激的RAW264.7细胞中，Phe362和Gln384突变也消除了WED的抗炎和抗氧化作用，表明氨基酸残基 Phe362和Gln384是WED与sEH结合的重要位点。

图5 蟛蜞菊内酯改善ALI的直接靶点

3、蟛蜞菊内酯通过靶向sHE发挥作用

已有研究表明抑制sEH会抑制GSK3β调控神经系统中NF-κB和Nrf2通路，研究人员发现sEH 敲低显著促进GSK3β的磷酸化，从而抑制GSK3β活性，WED对sEH的抑制可以降低 LPS暴露后巨噬细胞中的GSK3β活性，同时在sEH拯救后显著增加GSK3β活性（图6A），表明GSK3β是sEH在WED抗炎和抗氧化作用中的下游关键通路。最后体内实验发现sEH基因KO消除WED的肺保护作用（图6B），消除WED的抗炎和抗氧化作用（图6C），消除了WED对LPS暴露后巨噬细胞中的GSK3β活性的促进作用（图6D）。

图6 蟛蜞菊内酯通过靶向sHE发挥作用

蟛蜞菊内酯作用机制模式图如下：

总结与讨论

天然产物是药物发现的宝贵资源，挖掘他们在不同疾病种的疗效并阐明其作用靶点和作用机制对扩大其临床适应症至关重要。两个案例作为经典的药靶研究文章，其思路如下：

1）发现中药活性单体对改善疾病。通过细胞实验、动物实验发现中药活性单体（泽泻醇B和蟛蜞菊内酯）改善疾病(AKI和ALI)表型，并且影响疾病相关的生物学过程，如炎症反应等；

2）筛选中药活性单体的作用靶点。通过Pulldown+MS方法揭示直接靶点sEH并进行筛选和验证；（达吉特可提供包括Pulldown+MS在内的其他筛选策略，如20K人类蛋白组芯片、ABPP、DARTS等）

3）研究靶点下游的表型相关通路。通过细胞实验、动物实验发现将靶点敲除以后药物不再发挥治疗作用，且疾病表型相关的信号通路如炎症通路发生改变。

达吉特专注于药靶研究，可为您寻找药物靶点提供多种多样的专业的技术服务和解决方案，助您解决药物靶点-机理研究中的各种难题。 

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高精度鉴定；

2）中药有效成分与代谢物组织空间分布

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）天然产物化合物库筛选