基于炔基标记的ABPP技术是在点击化学和LC-MS质谱基础上发展起来的小分子化合物靶点蛋白的筛选技术。将小分子进行炔基标记后处理细胞，通过简便高效的点击化学反应，将结合上靶点蛋白的炔基小分子连接到带有叠氮的磁珠上，通过磁珠离心获取小分子靶向结合的靶点蛋白。进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。

基于炔基标记的ABPP实验流程

相较于Lip-MS等非标记技术，ABPP基于小分子对靶点的结合效应，对于靶点蛋白具有一定的富集效果，在LC-MS鉴定阶段能够一定程度排除非结合蛋白的背景干扰，鉴定靶点蛋白的效率更高。而相较于生物素标记的钓靶技术，ABPP由于标记的炔基基团较小，不容易影响小分子的活性以及穿膜效果，可以先用标记炔基的小分子处理活细胞后，再裂解细胞进行点击化学反应，进而进行靶点垂钓。基于上述优势，ABPP技术是CNS级别杂志最青睐的技术之一，为新靶点发现做出了突出贡献。

本文汇总了南方科技大学第一附属医院/中国中医科学院中药研究所王继刚教授团队近期在《Cell Commun Signal》（IF = 8.2）连载的两项重要成果，为大家揭示ABPP技术在小分子靶点钓取研究中的经典应用思路。

01  咖啡酸靶向乌头酸脱羧酶1（ACOD1），发挥神经保护作用

癫痫是一种慢性神经兴奋性障碍，在炎症过程中癫痫的发病风险会显著升高。咖啡酸（Caffeic Acid，CA）是一种天然的多酚类化合物，广泛存在于多种植物中。已有研究表明，咖啡酸具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌以及潜在的神经保护作用，但其在癫痫中的具体作用机制尚未明确。

2025年2月3日，王继刚教授团队发表题为“Activity-based chemical proteomics reveals caffeic acid ameliorates pentylenetetrazol-induced seizures by covalently targeting aconitate decarboxylase 1”的文章，发现咖啡酸（caffeic acid，CA）共价靶向乌头酸脱羧酶1（ACOD1），抑制其介导的PERK-NF-κB通路，发挥治疗癫痫和神经炎症相关疾病的作用。

1、咖啡酸在体内和体外均能发挥神经保护作用，抑制癫痫发作

首先，研究者通过戊四唑诱导的癫痫急性发作模型发现，咖啡酸（CA）能够显著抑制模型小鼠的癫痫发作频率和持续时间（图1A）。此外，研究者在点燃模型小鼠中发现，CA对癫痫的治疗作用与其抗炎作用有关，Western Blot和ELISA实验结果表明，CA能够显著降低TNF-α和IL-1β的水平（图1B）。进一步，研究者采用LPS刺激BV2小胶质细胞，建立体外神经炎症模型，发现CA具有抗神经性炎症作用（图1C）。

图1 咖啡酸在体内和体外均能发挥神经保护作用，抑制癫痫发作

2、ACOD1是咖啡酸的直接作用靶点

为了探究CA发挥抗神经炎症的作用机制，研究者利用炔基标记CA，合成了保留原有抗炎活性的小分子探针CA-P，并利用ABPP技术筛选CA在BV2胞中的作用靶点（图2A-B）。实验结果显示，顺乌头酸脱羧酶1（ACOD1），也被称为免疫响应性基因1（IRG1）是CA的潜在靶点蛋白（图2C）。随后，研究者利用Pull down/CETSA+WB证明了CA与ACOD1的相互作用（图2D-E）。此外，研究者探究了二者结合的氨基酸位点，结果显示CA与ACOD1的半胱氨酸残基共价结合并抑制其酶活性。

图2 ACOD1是咖啡酸的直接作用靶点

3、CA通过ACOD1介导的PERK-NF-κB信号通路，发挥抑制神经性炎症作用

最后，研究者深入探讨了CA靶向ACOD1发挥神经保护作用的深入机制。鉴于PERK-NF-κB信号通路在响炎症反应中发挥的重要作用，研究者探究了CA对该通路的调控作用，敲除实验和Western Blot结果显示，CA能够直接作用于ACOD1，抑制其酶活性，并通过调节ACOD1介导的PERK-NF-κB信号通路，抑制神经性炎症的发生，从而发挥抗癫痫发作的作用（图3A-B）。

图3  CA通过ACOD1介导的PERK-NF-κB信号通路发挥抑制神经炎症作用

综上，本研究发现小分子咖啡酸在抑制神经性炎症和癫痫发作中的显著疗效，其作用在体内外实验中均得到了验证。深入的机制研究发现，咖啡酸通过抑制PERK-NF-κB信号通路发挥其治疗作用。本研究利用ABPP技术鉴定了咖啡酸的作用靶点是ACOD1，这一发现为癫痫和神经性炎症疾病的治疗提供了新的潜在靶点，也为新药开发提供了坚实的理论基础。

02 二氢咖啡酸靶向TALDO1发挥抗炎作用

同期上线的另一项研究，题为“Chemo-proteomics reveals dihydrocaffeic acid exhibits anti-inflammation effects via Transaldolase 1 mediated PERK-NF-κB pathway”，揭示了二氢咖啡酸（dihydrocaffic acid，DA）通过靶向转醛醇酶1（TALDO1）介导的PERK-NF-κB信号通路，发挥抗炎作用。

炎症反应介导的组织损伤见于多种器官系统，是多种疾病病理进展的关键因素。二氢咖啡酸（Dihydrocaffeic acid，DA）是绿原酸的代谢产物，也是咖啡的主要成分之一。DA已被证实具有抗氧化、抗炎及细胞保护等多种生物学活性。尽管已有研究表明，DA在多种疾病中表现出显著的抗炎特性，但其在治疗急性肺炎等炎症相关疾病的作用机制仍不清楚。本研究具体内容如下：

1、二氢咖啡酸在体内和体外均具有抗炎作用

首先，研究者利用脂多糖（LPS）建立急性肺炎小鼠模型，实验结果显示，DA能够显著减轻模型小鼠的肺组织损伤和炎症浸润（图1A），还能够有效降低LPS引起的肺组织中炎症因子水平升高（图1B）。进一步，研究者建立了体外炎症细胞模型，与体内实验结果一致，DA能够浓度依赖性地减少NO的释放（图1C）。以上结果表明，DA在体内外均具有显著的抗炎作用。

图1  二氢咖啡酸在体内和体外均具有抗炎作用

2、TALDO1是二氢咖啡酸的作用靶点

接下来，研究者设计并合成了DA小分子探针（DA-P），确认了该探针仍具有原型小分子的抗炎活性后（图2A-C），利用ABPP技术筛选DA的靶点蛋白，结果显示，转醛醇酶1（TALDO1）是DA的潜在作用靶标（图2D）。进一步的pull down/CETSA+WB等实验证实了DA与TALDO1的直接结合，并能够浓度依赖性地抑制TALDO1的酶活性（图2E）。此外质谱分析结果显示，TALDO1的Cys250被DA共价修饰（图2F）。

图2  TALDO1是二氢咖啡酸的作用靶点

3、二氢咖啡酸通过靶向TALDO1，调控PERK-IκBα-NF-κB信号通路，发挥抗炎作用

最后，研究者探索了DA靶向TALDO1以抑制炎症反应的分子机制。Western blot结果显示，DA显著抑制了TNF-α、p-PERK和NF-κB p65的表达水平，而该通路与炎症反应密切相关，表明DA可能通过抑制该信号通路发挥抗炎作用。进一步的功能性实验结果证实，DA通过与TALDO1相互作用，调控PERK-IκBα-NF-κB信号通路，从而发挥抗炎作用（图3A）。

综上，本研究发现了小分子二氢咖啡酸对于急性肺炎等炎症相关疾病具有潜在的治疗效果，进一步通过ABPP实验发现了二氢咖啡酸作用靶点是TALDO1。机制研究发现，二氢咖啡酸通过TALDO1介导的PERK-IκBα-NF-κB信号通路，有效地抑制炎症反应。本研究为炎症相关疾病的治疗提供了新的策略。

靶点的筛选与验证是药物机制研究的起点，亦是其中最为关键的环节。王继刚教授团队的两项研究采用基于炔基标记的点击化学技术（即ABPP技术），成功筛选出咖啡酸和二氢咖啡酸的靶点蛋白，为癫痫和炎症相关疾病的治疗提供了新的策略和研究靶标。基于炔基标记的ABPP技术对原型小分子的活性和结构影响较小，不仅能够在细胞或组织裂解液水平上进行靶点筛选，还可在活细胞水平上开展实验，是小分子药物及天然产物靶点筛选的重要技术之一。达吉特可提供上述完整服务。

达吉特深耕于小分子靶点筛选领域多年，因为专注所以专业。针对小分子靶点研究，无论是天然化合物还是体内代谢物，达吉特均有合适的筛靶方案提供。截止目前，达吉特已经帮助中国科研工作者在种类多样的小分子靶点筛选工作中取得重要突破，相关研究成果多次出现在STTT、Mol Cancer、Circ Res、J. Hepatol、Nat Commun、PNAS、APSB等国际著名学术期刊上。筛靶就找达吉特也逐步成为业界共识。

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高精度鉴定；

2）中药有效成分与代谢物组织空间分布

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9)药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）天然产物化合物库筛选

业务咨询400-869-2936或17316301592（微信同号）

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