膜蛋白大约占所有生物体蛋白质编码基因的25%，它们参与物质运输、信号传导、细胞间通讯、免疫反应等多种生命活动，在细胞的生理功能中扮演着至关重要的角色。许多疾病的发生与膜蛋白的功能异常密切相关。例如，某些癌症的发生可能与膜蛋白的异常表达或功能失调有关。神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病也涉及膜蛋白的异常聚集和功能障碍。膜蛋白的异常表达或功能失调可能导致细胞信号传导紊乱，进而引发细胞增殖失控、凋亡障碍等病理变化。

膜蛋白是许多药物的作用靶点。例如，许多抗生素和抗病毒药物通过靶向细菌或病毒的膜蛋白来发挥作用。在癌症治疗中，靶向膜蛋白的药物也显示出良好的疗效。研究膜蛋白的结构和功能有助于开发更有效的药物，提高治疗效果并减少副作用。但目前应用广泛的一些靶点筛选技术如pull down、ABPP等，对于小分子下游膜蛋白的筛选并不具有良好的表现。一方面受限于膜蛋白本身的跨膜结构，另一方面受限于小分子与细胞内的膜蛋白结合依托于膜蛋白构像，洗脱时两者间的非公价结合容易断开。

达吉特推出了一款更适合用于确认小分子下游膜蛋白的靶点筛选技术。SPIDER是于2023年由上海交通大学科研团队研发的一项新型临近标记技术。是一种基于结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用。使用SPIDER技术进行靶点筛选实验前，需要先对小分子进行生物素标记。将生物标记的小分子与活细胞共同孵育反应，当小分子与靶蛋白（Target）发生相互作用时，会同时与偶联了生物素的SA_m-Pup^E靠近。在PafA酶的催化作用下，Pup^E的C末端会与Target蛋白表面的赖氨酸残基共价相连，形成类泛素连接反应，进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。该过程将小分子与蛋白质之间的非共价结合相互作用转换为SA_m-Pup^E与靶蛋白的共价连接，从而能够稳定地用于后续靶蛋白的富集、鉴定和分析。

SPIDER靶点筛选技术开创了小分子-膜蛋白互作研究的新范式，其核心优势在于：

（1）活细胞水平筛选

SPIDER技术能够在活细胞水平上进行靶点筛选，这样可以保证膜蛋白的活性，从而更真实地反映小分子与膜蛋白靶点在生理条件下的相互作用情况。这对于筛选出具有生物学意义的小分子下游膜蛋白靶点至关重要。

（2）非共价结合转化为共价结合

将小分子与膜蛋白的非共价结合转化为膜蛋白与偶联在小分子上的SA_m-Pup^E的共价结合。小分子与膜蛋白的连接不再依赖于膜蛋白本身的构象，使得小分子与靶蛋白的结合更加稳定，便于后续的富集和鉴定。

（3）严苛洗脱条件降低非特异性干扰

由于Biotin与Streptavidin相互作用是目前自然界已知最强的非共价结合，并且能够耐受较为严苛的环境不会解离，如加热、8 M尿素洗脱等，因此在SPIDER体系中，可以将小分子与Target的结合模式认为类似于共价结合。这样在洗脱时采用严苛条件，能够有效降低非特异性结合蛋白的干扰，使得结果更加灵敏、特异和稳定。

（4）适用范围广泛

SPIDER技术对于任何可偶联生物素分子的诱饵均适用，应用范围广泛。对于目前许多研究难点，如弱相互作用及瞬时相互作用蛋白、小分子靶蛋白等也适用。且可兼容完整细胞检测，特别适用于活细胞表面蛋白筛选。

（5）筛选弱相互作用及瞬时相互作用的膜蛋白靶点

SPIDER技术能够有效筛选出与小分子发生弱相互作用及瞬时相互作用的膜蛋白靶点，这是其他传统技术难以做到的。这对于研究小分子药物的作用机制和发现新的药物靶点具有重要意义。

已有实验表明SPIDER技术能够有效识别目标目的蛋白的膜表面受体。

SARS-CoV-2的S蛋白为病毒表面的一类标志性跨膜蛋白，是由3个相同的亚基通过非共价键的方式结合形成的同源三聚体，其中球形的S1负责介导病毒与胞膜受体结合。血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽，目前认为在SARS-CoV-2感染中，ACE2为病毒进入细胞的主要受体。在SARS-CoV-2 S1亚基识别并结合受体的过程中起到关键作用的是S1亚基上的RBD（receptor binding domain，受体结合域），因此选取了H1299、Calu-3和Vero E6三种细胞利用SPIDER技术鉴定了SARS-CoV-2的RBD结合受体，并成功鉴定出了55个SARS-CoV-2 RBD结合受体，其中包括ACE2和Vimentin。通过将识别出的RBD结合位点与BioGRID数据库进行比对，我们发现二者交集包括13个受体，例如ACE2, ITGA6, RPSA and LDLR。

在膜蛋白研究这场"攻坚战"中，SPIDER技术犹如装上热成像仪的狙击枪，让曾经"看不见"的靶点无所遁形。选择SPIDER，不仅是选择一项新技术，更是选择下一代药物发现的制高点。关注公众号“达吉特”或搜索上海达吉特药业科技有限公司官网www.tgtmed.com，开启您的靶点发现"超视距作战"！

参考文献：

[1] Hegde RS, Keenan RJ. The mechanisms of integral membrane protein biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23(2):107-124. doi:10.1038/s41580-021-00413-2.

[2] Jiang HW, Chen H, Zheng YX, et al. Specific pupylation as IDEntity reporter (SPIDER) for the identification of protein-biomolecule interactions. Sci China Life Sci. 2023;66(8):1869-1887. doi:10.1007/s11427-023-2316-2.

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