药物靶点鉴定一直是机制研究中的重点，要想将中药小分子研究进一步拔高，寻找到其直接作用靶点是至关重要的一步，例如pulldown等传统的寻靶手段鉴定到的靶点蛋白大多为小分子的间接结合蛋白，那么如何筛选到药物的直接靶点蛋白呢？利用 20K人类蛋白质组芯片就可以实现。该技术的优点在于：无需细胞培养和转染实验，可确定直接结合蛋白，无需质谱鉴定，一张芯片确定的靶点信息可能同时适用于多种疾病或细胞类型。

本文以时间顺序为大家系统性展示了中药小分子雷公藤红素、熊果酸和丹参素钠利用一次20K人类蛋白质组芯片实验（达吉特提供芯片服务）的结果寻找到其多个直接作用靶点发表多篇文章的案例，供大家学习。

2020年2月，温州医科大学梁广教授团队在Circ Res上发表题为“Celastrol Attenuates Angiotensin II–Induced Cardiac Remodeling by Targeting STAT3”的文章。研究人员利用HuProt 20K人类蛋白质组芯片筛选到天然产物雷公藤红素的直接靶点蛋白STAT3，结果发现雷公藤红素可以通过与STAT3的第207位氨基酸结合抑制了Ang II诱导的STAT3核转移；同时，通过与STAT3的第635/637位氨基酸结合抑制了Ang II诱导的STAT3磷酸化，进而促进了肥大纤维化相关基因的表达，发挥了保护心脏的功能。

图1 雷公藤红素治疗心肌肥厚的直接靶点研究

2020年8月，该团队在Theranostics上又发表了题为“Celastrol induces ROS-mediated apoptosis via directly targeting peroxiredoxin-2 in gastric cancer cells”文章。研究人员利用同一次HuProt 20K人类蛋白质组芯片的结果筛选到天然产物雷公藤红素的另一个直接靶点蛋白PRDX2，研究表明雷公藤红素可直接结合并抑制PRDX2蛋白活性，进而上调ROS水平，并导致 ROS 依赖的内质网应激和线粒体功能障碍，最终导致胃癌细胞凋亡。

图2 雷公藤红素治疗胃癌的直接靶点研究

2021年9月21日，上海中医药大学联合广州中医药大学第一附属医院刘凤斌教授团队在Biomedicine & Pharmacotherapy 上发表题为“Regulation of decorin by ursolic acid protects against non-alcoholic steatohepatitis”的文章，该团队利用HuProt 20K人类蛋白质组芯片筛选到熊果酸的直接靶点蛋白decorin。研究发现，熊果酸通过上调decorin的表达来激活IGF-IR信号通路、抑制HIF-1信号通路，从而对代谢紊乱和肝脏缺氧提供双重保护作用，发挥了改善非酒精性脂肪肝疾病的功能。

图3 熊果酸改善非酒精性脂肪肝的直接靶点研究

2024年4月16日，上海中医药大学联合广州中医药大学第一附属医院刘凤斌教授团队在Clin Mol Hepatol上发表题为“Ursolic acid targets secreted phosphoprotein 1 to regulate Th17 cells against metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease”的文章，该团队利用HuProt 20K人类蛋白质组芯片的研究结果发现熊果酸也可以直接与靶蛋白SPP1结合并调节其活性，且SPP1 可以直接与 ITGB1 和 CD44 相互作用，通过影响下游 ERK 信号通路促进Th17细胞分化，进而改善代谢功能障碍相关脂肪肝的免疫炎症。

图4 熊果酸治疗代谢功能障碍相关脂肪肝的直接靶点研究

2022年9月天津中医药大学姜希娟教授团队在Frontiers in Pharmacology 上发表题为“Sodium danshensu attenuates cerebral ischemia–reperfusion injury by targeting AKT1”的文章，该团队利用网络药理学和HuProt 20K人类蛋白质组芯片筛选到丹参素钠的主要直接靶点蛋白AKT1，研究发现丹参素钠通过与 AKT1 蛋白的 PH 结构域结合，进而激活AKT1，提高了其下游调节剂 mTOR 的磷酸化水平，减弱了脑缺血再灌注损伤诱导的细胞坏死和凋亡，发挥其在缓解 脑缺血再灌注损伤方面的积极作用。

图5 丹参素钠缓解脑缺血再灌注损伤的直接靶点研究

2023年7月10日天津中医药大学姜希娟教授团队在Biomedicine & Pharmacotherapy上发表题为“Sodium Danshensu stabilizes atherosclerotic vulnerable plaques by targeting IKKβ mediated inflammation in macrophages”的文章，该团队利用HuProt 20K人类蛋白质组芯片的研究结果发现丹参素钠也可以直接与靶蛋白IKKβ结合，进而有效抑制NF-κB通路，导致减少主动脉斑块的形成和面积的扩增，最终缓解动脉粥样硬化斑块破裂并抑制炎症反应。

图6 丹参素钠缓解动脉粥样硬化斑块破裂的直接靶点研究

2023年7月17日天津中医药大学姜希娟教授团队在Biofactors上发表题为“Sodium Danshensu ameliorates cerebral ischemia/ reperfusion injury by inhibiting CLIC4/NLRP3 inflammasome-mediated endothelial cell pyroptosis”的文章，该团队再次利用HuProt 20K人类蛋白质组芯片的研究结果发现丹参素钠在缓解脑缺血再灌注损伤方面的直接靶点蛋白CLIC4 ，研究发现丹参素钠可以降低直接靶点蛋白CLIC4的表达并抑制其易位，且通过与 CLIC4 结合来阻断内皮细胞焦亡，从而抑制氯化物外排依赖性 NLRP3 炎症小体活化，最终减轻脑缺血/再灌注损伤。

图7 丹参素钠减轻脑缺血再灌注损伤的直接靶点研究

达吉特推出的20K人类蛋白组芯片，覆盖超过2万种人类全长蛋白质。该芯片已经在小分子靶标研究、蛋白质相互作用、核酸与蛋白互作研究中得到广泛应用，芯片上的蛋白质在功能上覆盖较为全面，且在使用过程中并未限制研究人员的疾病方向，所以客户在进行中药小分子靶标研究过程中利用做一次芯片得到的实验结果可发表多篇不同疾病方向的文章，较其他技术来讲性价比较高。

中药物质基础研究及小分子药物靶点发现一直是达吉特专注的科学领域，我们希望达吉特能为越来越多的中药及复方走向全世界的过程中提供有价值的技术支持。

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高精度鉴定；

2）中药有效成分与代谢物组织空间分布

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）天然产物化合物库筛选