小分子筛选下游靶点蛋白是药物发现、疾病机制研究以及生物学功能探究中的关键环节。小分子药物结合靶点蛋白的发现，不仅能帮助理解疾病的分子机制，也能指导药物的设计与优化，从而提高药效、减少副作用，并推动精准医疗的发展。达吉特针对此提供了两类不同的靶点筛选方案，方案一：基于修饰的策略，引入标记基团，提高筛选效率，便于后续分析，适用于可以进行生物素或炔基标记的小分子；方案二：非修饰策略，适用于不能够进行化学修饰的小分子，保持小分子原貌，技术难度较低，直接反应小分子与靶点的相互作用。从小分子标记到小分子靶点筛选再到小分子靶点蛋白的验证，达吉特具备全链条服务体系，帮助研究人员在多个阶段有效筛选和验证潜在的药物靶点。

丨 方案一：基于修饰的策略

No.1  20K人类蛋白组芯片

芯片上有超过2万种人类全长蛋白质，覆盖81%的人类基因组ORF区，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片。将带有生物素标记的小分子与20K芯片共同孵育，再引入带有CY3或CY5荧光的链霉亲和素，通过检测芯片上的荧光信号，即可确定小分子的直接结合靶蛋白。20K芯片不仅能够筛选出与小分子直接结合的靶点蛋白，还能解决传统方法中由于蛋白丰度低而难以捕捉的药-靶结合问题，更因其具备丰富的蛋白种类，单次实验即可产出多项科研成果，具有极高性价比。

丨 技术路线

Step1：将小分子标记上生物素

Step2：标记了生物素的小分子和芯片共同孵育

Step3：加入带有荧光的链酶亲和素

Step4：固定波长下进行荧光检测，读取芯片上的荧光信号值

丨 芯片优势

1.  筛选直接结合的靶点蛋白，假阳性率较低

2. 无需克隆构建、细胞培养和转染实验

3. 芯片覆盖多种蛋白类型，结合蛋白范围更广，性价比较高

4. 采用酵母表达纯化，蛋白丰度高，可检测到微弱蛋白互作现象

经典案例：20K芯片确定雷公藤红素的多靶点与多效性

温州医科大学药学院梁广教授团队使用生物素标记雷公藤红素，利用一次20K人类蛋白组芯片实验的结果寻找到其多个直接作用靶点蛋白，发现雷公藤红素能够直接靶向信号转导及转录激活蛋白3 （STAT3）和过氧化还原蛋白2（Prdx2）。确定雷公藤红素的直接靶点蛋白后，通过功能性实验证明了雷公藤红素在治疗胃癌和保护心脏方面发挥一定的作用。

No.2  ABPP基于炔基标记的点击化学技术

ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在点击化学和LC-MS质谱基础上发展起来的小分子化合物靶点蛋白的筛选技术。将小分子进行炔基标记后处理细胞，通过简便高效的点击化学反应，将结合上靶点蛋白的炔基小分子连接到带有叠氮的磁珠上，通过磁珠离心获取小分子靶向结合的靶点蛋白。进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。

丨 技术路线

Step1：小分子进行炔基标记 

Step2：标记了炔基的小分子与细胞共孵育

Step3：预实验，使用荧光标记的叠氮与细胞裂解液共同孵育，通过荧光凝胶以及荧光成像系统检测反应条带

Step4：正式实验，使用生物素标记的叠氮与细胞裂解液共同孵育

Step5：利用链霉亲和素磁珠钓出靶蛋白

Step6：质谱分析，鉴定靶蛋白 

丨 特点优势

1.  炔基修饰对小分子的活性和结构影响小，几乎不干扰小分子原本的生物活性

2.  炔基标记的小分子可在活细胞水平上进行靶点筛选

3.  研究方向明确，筛选到的是与研究方向相关的靶点蛋白

4.  拥有完整的小分子炔基标记体系

经典案例：ABPP筛选天然产物野马追内酯B抗癌靶点

南方科技大学第一附属医院联合中国医学科学院研究团队利用炔基标记天然产物野马追内酯B（EB），合成了保留原有抗三阴乳腺癌活性的小分子探针，并利用ABPP技术筛选EB的靶点蛋白。实验结果显示，EB通过靶向BCAT1介导的BCAA代谢抑制SHOC2/RAS/ERK激活，最终抑制癌细胞增殖并促进细胞凋亡。本研究发现了三阴乳腺癌的治疗新靶标，为其临床新药开发提供了新的思路。

No.3  Pull down+MS技术

小分子药靶筛选的Pull down实验是一种有效的筛选药物与潜在靶蛋白之间相互作用的体外技术。利用生物分子之间的亲和力原理，将生物素标记的小分子化合物固定在链霉亲和素的磁珠上，与蛋白裂解液进行孵育，孵育结束后与小分子结合的蛋白可以通过质谱检测，将下游的靶点蛋白鉴定出来。该方法简单易行，操作方便，在药靶筛选方面已得到广泛的应用。

丨 技术路线

Step1：小分子进行生物素标记 

Step2：标记了生物素的小分子与链霉亲和素磁珠共同孵育，将小分子固定到磁珠上，形成小分子探针

Step3：将小分子探针与细胞裂解液共同孵育

Step3：离心、洗脱，获取靶蛋白

Step4：质谱分析，对靶蛋白进行鉴定

丨 特点优势

1.  不受结合原理限制，适用范围广

2.  研究方向明确，筛选到的是与研究方向相关的靶点蛋白

3.  鉴定到的靶点蛋白数量较多 

4.  可检测到细胞内与小分子结合的靶点蛋白及其互作网络谱

经典案例：Pull down +MS筛选苏木酮A的抗炎靶点

2017年7月北京大学屠鹏飞教授团队利用Biotin-SA探针进行Pull down+MS实验“垂钓”苏木酮（SA）的潜在靶点蛋白，发现肌苷单磷酸脱氢酶2（IMPDH2）是SA的关键作用靶点，通过SPR和CETSA实验进一步验证了SA与IMPDH2的直接作用关系，后续通过功能性实验证明了苏木酮A在抗神经炎症方面的作用功效。

No.4  SPIDER基于邻近标记技术的膜蛋白靶点筛选技术

SPIDER技术的原理基于结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用。将小分子进行生物素标记后处理活细胞，当小分子与靶蛋白（Target）发生相互作用时，会同时与偶联了生物素的SA_m-Pup^E靠近。在PafA酶的催化作用下，Pup^E的C末端会与Target蛋白表面的赖氨酸残基共价相连，形成类泛素连接反应，进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。该过程将小分子与蛋白质之间的非共价结合相互作用转换为SA_m-Pup^E与靶蛋白的共价连接，从而能够稳定地用于后续靶蛋白的富集、鉴定和分析。

丨 技术路线

Step1：小分子进行生物素标记 

Step2：标记了生物素的小分子与活细胞共同反应

Step3：引入带有Pup^E的链酶亲和素和PafA酶 

Step3：利用生物素磁珠钓取靶蛋白

Step4：质谱分析，对靶蛋白进行鉴定

丨 特点优势

1. 在活细胞水平上进行靶点筛选，能够保证膜蛋白的活性；

2. 将小分子与互作蛋白转为共价结合，形成类泛素化连接反应；

3. 严苛洗脱条件降低非特异性干扰。

经典案例：SPIDER筛选SARS-CoV-2S1蛋⽩受体结合区RBD的靶点蛋白

上海交通大学首次利用SPIDER技术检测了SARS-CoV-2S1蛋⽩受体结合区RBD的靶蛋白，同时进行了毒性测试，证明了整个类泛素反应的无毒害性。将SPIDER实验筛选结果与BioGRID数据库相比较取交集，筛选到SARS-CoV-2S1蛋⽩的膜上受体蛋白ACE2，后续通过体内与体外实验证明了二者之间的直接作用关系。

丨 方案二：非修饰的策略

No1. DARTS药物亲和反应靶向稳定性技术

药物亲和反应靶向稳定性技术（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS）是由美国University of California科研团队于2009年提出的。该方法操作简便，可适用于大多数小分子化合物。DARTS技术是基于蛋白的酶解稳定原理，即小分子和靶点蛋白结合后增强靶点蛋白的酶解稳定性。在正常情况下，靶点蛋白容易被广谱的蛋白酶水解成多个肽段。然而，当小分子化合物与靶点蛋白结合后，这种结合作用会稳定靶点蛋白的结构，使其更难被蛋白酶水解。比对加药组与未加药组蛋白酶处理后的蛋白残留情况，最后通过质谱鉴定到小分子的潜在靶点蛋白。

丨 技术路线

Step1：预实验，摸索最适酶浓度

Step2：正式实验，小分子与靶细胞裂解液共孵育，根据预实验结果选取最适酶浓度处理，进行SDS-PAGE凝胶电泳

Step3：利用质谱鉴定靶点蛋白

丨 特点优势

  1. 小分子无需修饰，其构象与活性不产生影响

  2. 实验原理简单，服务周期短

  3. 每组3重复，排除个体差异

  4. 不适于在自然条件下抵抗蛋白质水解的蛋白质或蛋白质结构域

经典案例：外泌体+DARTS发现人参皂苷Rb1对结直肠癌的治疗作用

上海中医药大学曙光医院联合了药物靶点和外泌体机制两大研究热点，发现携带circ-0034880的外泌体可以促进结直肠癌的肝转移，随后筛选到了能够显著抑制该环状RNA表达的中药活性成分人参皂苷Rb1。进一步采用DARTS技术鉴定到了人参皂苷Rb1的作用靶点是与环状RNA生物发生相关的蛋白QKI。通过CETSA和SPR方法验证了二者间的相互作用。最后体内功能实验证明了Rb1预处理的肿瘤细胞来源的外泌体失去了促进癌症肝转移的作用。

No2. LiP-MS限制性酶解-质谱分析技术

限制性酶解-质谱分析技术LiP-MS（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry）是一种基于有限蛋白酶切的化合物靶点筛选技术，其独特之处在于无需对化合物进行修饰即可实现对特定化合物结合肽段进行筛选。小分子与蛋白质相互作用后，利用两种蛋白酶交叉切割，最后利用质谱技术分析酶解的多肽产物，通过数据分析比对两种酶作用后产生的多肽及位点的不同，鉴定出能够与小分子结合的特定肽段，从而确定小分子结合的靶点蛋白。

丨 技术路线

Step1：小分子与靶细胞裂解液共孵育

Step2：PK酶处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳

Step3：酶解样品，利用质谱鉴定靶点蛋白

丨 特点优势

1. 无需对小分子进行修饰，避免了因修饰可能导致的小分子活性改变，服务周期短

2. 能够筛选到小分子与靶点蛋白结合的肽段，可进行个性化数据分析

3. 实验设置每组3重复，排除个体差异

4. 更适用于代谢产物及小分子量化合物的靶点筛选研究

经典案例：LiP-MS技术绘制代谢物-蛋白相互作用图谱

苏黎世联邦理工学院2018年发表在Cell上的文章首次利用LiP-MS技术系地绘制了代谢物的蛋白结合谱，鉴定出三羧酸循环中大多数代谢物的靶点蛋白。在天然细胞基质中直接进行的代谢物-蛋白质相互作用和结合位点的系统分析，并确定了二者结合后靶点蛋白整体构象发生变化的原因。

No.3 CETSA细胞热转移技术

细胞热转移技术（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是2013年由瑞典Karolinska研究所团队研发的一项实验技术。该技术基于蛋白的热稳定性原理，即小分子与靶点蛋白结合后会增强靶点蛋白的热稳定性。随着温度的升高，部分蛋白会逐渐降解。相同温度下，结合了药物的蛋白质具有更高的热稳定性，相比未结合药物的蛋白质，未降解蛋白的量会提高，同时该复合蛋白的热熔曲线发生改变，进一步通过质谱鉴定到小分子的潜在靶点蛋白。

丨 技术路线

Step1：小分子与靶细胞共孵育

Step2：进行梯度升温处理后离心，从沉淀蛋白中分离出可溶性蛋白

Step3：收集上清液，利用质谱鉴定靶点蛋白

丨 特点优势

1.  小分子无需修饰，其构象与活性不产生影响

2.  实验原理简单，服务周期短

3.  需要提供靶细胞，研究方向明确

4.  不适用于在自然条件下耐温的蛋白质

经典案例：CETSA+MS助力揭示天然产物缓解神经性疼痛的新机制

2023年中国医学科学院药物研究所庾石山团队利用CETSA+MS（TPP）技术，鉴定到木藜芦烷毒素Rho的主要靶点蛋白N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白 （NSF），通过ITC与分子对接实验进一步验证了二者的的直接作用关系。结果表明Rho通过抑制NSF介导的Cav2.2钙通道跨膜运输缓解神经性疼痛。

丨 客户文献

[1]. Han D, Zhou T, Li L, et al. AVCAPIR: A Novel Procalcific PIWI-Interacting RNA in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation. 2024;149(20):1578-1597. Published 2024 Jan 23.（华中科技大学同济医学院协和医院）IF=35.5

[2]. Chen L, Qi Q, Jiang X, et al. Phosphocreatine Promotes Epigenetic Reprogramming to Facilitate Glioblastoma Growth Through Stabilizing BRD2. Cancer Discov. 2024;14(8):1547-1565. Published 2024 Apr 2.（国家生物医学分析中心南湖实验室）IF=29.7

[3]. Zhou J, Song Q, Li H, et al. Targeting circ-0034880-enriched tumor extracellular vesicles to impede SPP1^highCD206⁺ pro-tumor macrophages mediated pre-metastatic niche formation in colorectal cancer liver metastasis. Mol Cancer. 2024;23(1):168. Published 2024 Aug 20. （上海中医药大学附属曙光医院）IF=27.7

[4]. Li D, Wei R, Zhang X, et al. Gut commensal metabolite rhamnose promotes macrophages phagocytosis by activating SLC12A4 and protects against sepsis in mice. Acta Pharm Sin B. 2024;14(7):3068-3085. Published 2024 Mar 22.（南方医科大学）IF=14.7

[5]. Deng Y, Zeng L, Liu H, et al. Silibinin attenuates ferroptosis in acute kidney injury by targeting FTH1. Redox Biol. 2024 Nov;77:103360.  Published 2024 Sep 20.（哈尔滨医科大学附属第二医院）IF=14.3

[6]. Zheng Y, Zhao L, Xiong Z, et al. Ursolic acid targets secreted phosphoprotein 1 to regulate Th17 cells against metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease. Clin Mol Hepatol. 2024 Jul;30(3):449-467. Published 2024 Apr 16. （上海中医药大学）IF=14.0

[7]. Xu L, Liu Q, Liu H, et al. Disrupting CCDC137-mediated LZTS2 and β-TrCP interaction in the nucleus inhibits hepatocellular carcinoma development via β-catenin and AKT. Cell Death Differ. Published 2024 June 25.（华中科技大学）IF=13.7

[8]. Liu F, He H, Yang W, et al. Novel energy optimizer, meldonium, rapidly restores acute hypobaric hypoxia-induced brain injury by targeting phosphoglycerate kinase 1. Cell Commun Signal. 2024;22(1):383. Published 2024 Jul 29. （北京药理毒理研究所）IF=8.2

[9]. Lu H, Fan L, Zhang W, et al. The mitochondrial genome-encoded peptide MOTS-c interacts with Bcl-2 to alleviate nonalcoholic steatohepatitis progression. Cell Rep. 2024;43(1):113587. Published 2024 Jan 11. （西安第四军医大学）IF=7.5

[10]. Sheng R, Li Y, Wu Y, et al. A pan-PPAR agonist E17241 ameliorates hyperglycemia and diabetic dyslipidemia in KKAy mice via up-regulating ABCA1 in islet, liver, and white adipose tissue. Biomed Pharmacother. 2024;172:116220. Published 2024 Feb 2.（北京协和医学院）IF=6.9

[11]. Ma X, Zhang W, Chen Y, et al. Paeoniflorin inhibited GSDMD to alleviate ANIT-induced cholestasis via pyroptosis signaling pathway. Phytomedicine. 2024;134:156021. Published 2024 Sep 03. （成都中医药大学）IF=6.7

[12]. Kang Z, Wang P, Wang B, et al. Echinatin suppresses cutaneous squamous cell carcinoma by targeting GSTM3-mediated ferroptosis. Phytomedicine. 2024;131:155752. Published 2024 May 26. （同济大学）IF=6.7

[13]. Shan L, Chen Y, An G, et al. Polyphyllin I exerts anti-hepatocellular carcinoma activity by targeting ZBTB16 to activate the PPARγ/RXRα signaling pathway. Chin Med. 2024;19(1):113. Published 2024 Aug 24. （北京中医药大学）IF=5.3

[14]. Liu J, Ren Z, Sun Y, et al. Investigation of the Relationship between Aptamers' Targeting Functions and Human Plasma Proteins. ACS Nano. 2023;17(23):24329-24342. Published 2023 Dec 3.（上海交通大学医学院仁济医院分子医学研究所）IF=15.8

[15]. Zhong J, He X, Gao X, et al. Hyodeoxycholic acid ameliorates nonalcoholic fatty liver disease by inhibiting RAN-mediated PPARα nucleus-cytoplasm shuttling. Nat Commun. 2023 Sep 6;14(1):5451. Published 2023 Sep 06.（上海中医药大学）IF=14.7

[16]. Zhang C, Wang H, Liu Q, et al. LncRNA CCAT1 facilitates the progression of gastric cancer via PTBP1-mediated glycolysis enhancement. J Exp Clin Cancer Res. 2023;42(1):246. Published 2023 Sep 23.（河北医科大学第四医院研究中心）IF=11.4

[17]. Deng Y, Zeng X, Lv Y, et al. Cdyl2-60aa encoded by CircCDYL2 accelerates cardiomyocyte death by blocking APAF1 ubiquitination in rats. Exp Mol Med. 2023;55(4):860-869. Published 2023 Apr 3.（南京市第一医院）IF=9.5

[18]. Zhou GF, Tang J, Ma YL, et al. ARL6IP1 mediates small-molecule-induced alleviation of Alzheimer pathology through FXR1-dependent BACE1 translation initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(22):e2220148120. Published 2023 May 22.（重庆医科大学附属第一医院神）IF=9.4

[19]. Jia W, Liang S, Jin M, et al. Oleanolic acid inhibits hypoxic tumor-derived exosomes-induced premetastatic niche formation in hepatocellular carcinoma by targeting ERK1/2-NFκB signaling. Phytomedicine. 2024;126:155208. Published 2023 Nov 11.（海军军医大学第一附属医院）IF=6.7

[20]. Zhang X, Yang Q, Zhang R, et al. Sodium Danshensu ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting CLIC4/NLRP3 inflammasome-mediated endothelial cell pyroptosis. Biofactors. 2024;50(1):74-88. Published 2023 Jul 17. （天津中医药大学）IF=5.0

丨 相关产品