三氧化二砷（As₂O₃），俗称砒霜、白砒等，自古以来，一直被视为最著名的毒物之一，然而它展示在世人面前的另一面是作为古老的中药，当今As₂O₃在急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗中的作用已经很明确，并且对其它恶性肿瘤也具有显著治疗效果，是具有极高商业价值的砷化合物。

As₂O₃直接作用靶点的鉴定是揭开其作用机理的关键一环，然而该科学问题一直困绕着药学研究领域的专家学者们，华盈生物紧密合作伙伴上海交通大学陶生策教授课题组研究人员，应用高通量的20K人类蛋白质组芯片技术找到了300百多个As2O3结合蛋白，这些蛋白很大一部分都参与了糖酵解通路。As₂O₃通过抑制糖酵解途径的限速酶己糖激酶2（HK2），抑制细胞代谢引发肿瘤细胞凋亡的。此外，这项工作中鉴定的As₂O₃结合蛋白有望成为开发协同抗肿瘤治疗策略的宝贵资源。该研究成果被美国科学院院报（PNAS）收录（PMID:26598702），同时被评为小分子药物靶点研究的经典范文。

01  As₂O₃靶标蛋白筛选

为了鉴定As₂O₃的结合蛋白，研究人员采用HuProt 20K人类蛋白质组芯片（覆盖2万种人类全长蛋白）检测（图1A）。研究人员设置了实验组（As2O3-Biotin与芯片孵育）和对照组（Biotin和芯片孵育），为了确保结合的特异性，研究人员还设置了竞争组，即首先将100μM As₂O₃与芯片孵育，然后用10μM As₂O₃-Biotin +100μM As₂O₃与芯片进行孵育，发现As₂O₃-Biotin与芯片的结合点都消失了。图1B是随机选择的实验组和对照组芯片上的相同区域，显示实验组有更多的阳性信号。最终，研究人员共鉴定出360种与As₂O3直接相互作用的蛋白。图1C展示了其中部分结合蛋白，其中PML是已知的As2O3结合蛋白。

图1 As₂O₃靶标蛋白筛选

02  As₂O₃靶向糖酵解通路

为了深入了解As₂O₃结合蛋白的功能作用，研究人员对这360个结合蛋白进行GO分析和KEGG 通路分析，结果都显示糖酵解的显著富集（图2A-B）。构建的As₂O₃结合蛋白的相互作用网络揭示了紧密连接的簇（Cluster 1）由参与糖酵解途径或与糖酵解途径高度相关的许多酶组成（图2C）。为了评估在新鉴定的As₂O₃结合蛋白中是否存在共有序列，研究人员基于一级氨基酸序列进行了MEME基序检索， 确定了许多蛋白包含半胱氨酸（图2D）。该结果也与已知的As₂O₃对半胱氨酸的高亲和力一致，特别是对于许多相邻的半胱氨酸。

图2  As₂O₃靶向糖酵解通路

03   As₂O₃与HK2结合并抑制其体外活性

鉴于As₂O₃结合蛋白的多数被鉴定为糖酵解酶，研究人员对糖酵解的关键酶的功能性结果进行了更详细的体外表征。其中糖酵解酶HK1是As₂O₃的结合蛋白，因此研究人员也对HK2进行研究。尽管HK2不在人类蛋白质组芯片上，但已知该蛋白在肿瘤中维持高葡萄糖分解代谢率方面起关键作用，并且与HK1高度同源。因此，研究人员推断As₂O₃也可能与HK2结合。WB实验表明，As₂O₃能与HK2及其他糖酵解酶结合，并且加入As₂O₃解毒剂BAL后，结合作用显著降低（图3A）。研究人员利用生物膜层干涉技术（BLI）测定PML和HK2对As₂O₃的结合亲和力，发现它们与As₂O₃的相互作用相当强（Kd分别为860 nM和12.3 nM）（图3B）。进一步，研究人员通过CO-IP实验验证了As₂O₃-Biotin确实与细胞内的HK2结合，并且这种结合可以通过预先加入As₂O₃而减弱（图3C）。接着，研究人员测定了As₂O₃结合后对HK2活性的影响，发现2μM As₂O₃在体外急剧抑制HK2的活性，显著降低葡萄糖-6-磷酸（G6P）反应产物（图3D）。

图3 As₂O₃与HK2结合并抑制其体外活性

04  HK2过表达逆转As₂O₃诱导的细胞凋亡

05  HK2是体内As₂O₃的靶标

因为As₂O₃与直接参与糖酵解通路的大部分酶结合并抑制HK2的活性，研究人员在胃癌细胞系SGC7901中进行了代谢物变化的系统分析。糖酵解的第一步和限速步骤由HK2催化（图5A）。代谢组学分析显示，用As₂O₃处理12h的细胞中HK2的直接产物G6P浓度低于对照细胞，在24h更低（图5B）。此外，用As₂O₃处理24h的细胞中乳酸的浓度（糖酵解程度的指数）也低于对照细胞（图5C）。为了排除As₂O₃处理后改变了细胞中葡萄糖的浓度，而导致较低浓度的G6P和乳酸的可能性，对SGC7901细胞中葡萄糖的浓度进行研究，发现在所有时间点，As₂O₃处理细胞中葡萄糖的浓度与对照细胞没有显著差异（图5D）。这些结果表明As₂O₃显著抑制糖酵解，并表明抑制HK2活性是细胞内这种作用的主要因素。

图5 HK2是体内As₂O₃的靶标

总结与讨论

在本研究中，利用人类蛋白组芯片技术找到As₂O₃的直接结合蛋白对于揭开As₂O₃抗癌机制的大幕十分关键。在本研究之前的数年中，研究人员采用传统方法找到的As₂O₃直接作用靶点不超过20个，大部分研究都是从转录组和蛋白表达调控水平去间接解释As₂O₃的作用机理。陶生策教授的研究成果不仅让学界对于As₂O₃的作用机理有了更新的认识。同时，该研究的技术路线为小分子药物靶点的筛选和机制研究提供了新的技术示范。即通过蛋白质组芯片技术快速寻找经典小分子药物的直接作用蛋白，阐明药物调控机理。

20K人类蛋白质组芯片在筛选药物结合靶点研究中具有诸多优势：

• 更直接：芯片实验保证筛选到的互作蛋白均为直接结合蛋白，数据分析简单；

• 更全面：体内很多结合现象稍纵即逝，很难捕捉，芯片筛选可以发现更全的潜在结合；

• 更灵敏：芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白，可以保证每种蛋白的丰度，对于体内低丰度蛋白的结合也容易发现；

• 更高效：相比酵母双杂交实验，芯片实验周期短、假阳性率低，实验设计方便，可以设计多种实验对照，更能确保互作蛋白数据的准确性；

20K人类蛋白质组芯片近年来已经被广泛用于药物的靶点筛选研究，例如：

★雷公藤红素

温州医科大学药学院梁广教授与温州医科大学附属第一医院心内科黄伟剑教授课题组，联合攻关，综合运用Huprot 20K人类蛋白质组芯片、表面等离子共振（SPR）、计算机模拟分子对接技术等为雷公藤红素找到了新的分子靶点，确定雷公藤红素通过与STAT3直接结合，抑制血管紧张素(AngⅡ)诱导的心功能障碍的明确药物机理。相关研究成果发表于心血管研究著名杂志《Circulation Research》（IF=20.1）上。本文应用的实验技术路线可以为广大小分子药物研究工作者提供思路借鉴。