迅速增加的有氧糖酵解是经典激活巨噬细胞（M1型）最显著的代谢特征之一，之前的多项研究使用线粒体丙酮酸转运体（MPC）抑制剂UK5099阻断糖酵解代谢产物丙酮酸进入线粒体后，M1型巨噬细胞多种促炎细胞因子的水平显著降低，因此这些研究认为糖酵解生成丙酮酸并进入线粒体的代谢通路对于M1型巨噬细胞的激活至关重要。值得注意的是，这些结论是基于UK5099作为MPC抑制剂建立的。

近日，达吉特合作伙伴上海市东方医院（同济大学附属东方医院）呼吸与危重症医学科王飞龙课题组在 Nature Metabolism（IF=19.865）发表了题为“Mitochondrial pyruvate carrier-mediated metabolism is dispensable for the classical activation of macrophages”的研究文章，推翻了以往的观点。该研究发现MPC介导的代谢通路对于M1型巨噬细胞激活并无显著影响，而数十年来被代谢领域广泛使用的MPC抑制剂UK5099存在脱靶效应。

01  UK5099 独立于MPC抑制巨噬细胞激活

研究团队首先评估了不同浓度的UK5099对于LPS诱导的巨噬细胞促炎因子生成水平以及MPC活性的影响，发现UK5099在2-5μM即达到对MPC的最大抑制能力，能够有效地减少葡萄糖衍生的丙酮酸向线粒体的运输，但是其在25μM及以上才能够显著抑制促炎细胞因子的生成（图1A）。进一步研究发现，高浓度UK5099显著抑制了巨噬细胞氧化磷酸化水平以及膜电位，但低浓度UK5099并无上述效应（图1B）。因此，研究团队推测，UK5099的抗炎作用可能独立于其对于MPC的抑制效应。进而研究构建了骨髓细胞特异性敲除Mpc1的小鼠（Mpc1ΔLysM），发现敲除Mpc1阻断了葡萄糖和丙酮酸进入三羧酸循环，并不影响M1型巨噬细胞的代谢重编程平，亦不影响促炎细胞因子的转录和表达。高浓度UK5099不仅在对照组巨噬细胞上（Mpc1fl/fl）抑制了多种促炎细胞因子的生成，在缺乏MPC表达的巨噬细胞（Mpc1ΔLysM）上同样观察到此现象（图1C）。此外，高浓度UK5099在Mpc1fl/fl和Mpc1ΔLysM巨噬细胞上均显著抑制了氧化磷酸化水平（图1D）。RNA-seq分析结果也显示，UK5099改变的基因表达模式在Mpc1fl/fl和Mpc1ΔLysM 巨噬细胞之间是相似的（图1E）。上述结果表明MPC介导的代谢通路并不影响M1型巨噬细胞激活，且UK5099存在着脱靶效应。

图1 UK5099 独立于MPC抑制巨噬细胞激活

02  UK5099直接结合氧化还原酶活性相关蛋白

为了探索UK5099除MPC之外的潜在靶标，研究人员使用20K蛋白质组芯片（达吉特为该研究提供了20K芯片技术服务）确定其直接靶蛋白，该芯片靶向> 21000种人类蛋白质，覆盖约81%的人类蛋白质组。从该芯片中鉴定出总共156个候选UK5099结合蛋白。GO分析显示这些蛋白与NAD/NADP代谢和氧化还原酶活性相关（图2A），这与UK5099对细胞呼吸的抑制作用一致，也与前面的RNA-seq数据的GSEA分析结果一致，表明UK5099处理与Mpc1fl/fl和Mpc1ΔLysM BMDM中的氧化还原酶活性呈正相关（图2B）。这些数据表明UK5099通过直接结合相关蛋白来改变氧化还原酶活性。

图2 UK5099直接结合氧化还原酶活性相关蛋白

研究挑战了之前关于MPC介导的代谢通路促进经典激活巨噬细胞功能的观点，发现MCP介导的代谢途径不是巨噬细胞经典激活途径所必需，并揭示了UK5099这一广泛使用的MPC抑制剂存在脱靶效应，UK5099是通过抑制MPC以外的靶点来抑制M1巨噬细胞的炎症反应。这里研究人员为了探索UK5099除MPC之外的潜在靶标，采用20K蛋白质组芯片技术，鉴定出156个候选 UK5099结合蛋白，GO分析显示这些靶蛋白很多与NAD/NADP代谢和氧化还原酶活性相关，解释了UK5099不依赖于MPC调控巨噬细胞代谢进而抑制巨噬细胞活化的作用。

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